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《Nature》仿生电鳗的琼脂糖水凝胶制备方法大开眼界这才叫创新!

[编辑:永太净化设备经营部] [时间:2024-01-17]

  生物集成设备需要电源来操作。尽管广泛使用的技术可以为大规模目标提供能量,例如电池的有线能量供应或无线能量转换,但仍然迫切需要在微尺度上有效地刺激细胞和组织。理想的小型化电源应该具有生物相容性,机械灵活性,并且能够产生用于生物刺激的离子电流,而不是像传统的电子设备那样使用电子流。一种方法是使用受电线; 然而,结合所需能力的电源尚未生产出来,因为要获得既能在使用前节约所含能量又容易触发产生能量输出的小型化单元是具有挑战性的。在这里,我们通过沉积利用内部离子梯度产生能量的脂质支撑的纳升水凝胶液滴网络,开发了一种小型化的软动力源。与最初的电鳗设计相比,我们的方法可以将动力装置的体积缩小105倍以上,并且可以储存超过24小时的能量,使按需运行的功率密度提高680倍,约为1300W m-3。我们的液滴装置可以作为生物相容性和生物离子电流源来调节三维神经微组织和离体小鼠脑切片中的神经元网络活动。最终,我们的软微型离子电子设备可能会被整合到生物体中。

  与传统的大体积电池相比,软微型电源有望提高生物相容性和灵活性9。电鳗的电器官是利用离子通量发电的生物能源的一个例子。尽管一些研究调查了器官的发电行为,其他研究开发了数百平方厘米的大功率阵列来模拟这种行为,但没有一项研究创造出可以按需开启并与活细胞相互作用的多室微型离子电源。我们报道了一种微型软电源,该电源通过沉积纳升脂质支持的水凝胶液滴网络制成,该网络使用内部离子梯度来产生能量输出。液滴电源以高密度存储能量,并且在封装后具有生物相容性、机械柔性、可扩展性和便携性。我们证明,含有神经元的液滴与液滴装置的连接能够通过刺激细胞内Ca2+波来调节神经元网络活动的离子电流。

  电鳗(例如电鳗)的发电能力依赖于串联数千个电细胞(扩展数据图1) ,其中阳离子 Na + 和 k + 可以通过浓度梯度驱动的细胞膜中的离子选择性蛋白质通道。我们模拟了鳗鱼电器官的总体布局和机制,依次结合了五个水溶性纳升预凝胶(琼脂糖)液滴(图1a)。在单个单元中,液滴顺序为: 高盐(例如,CaCl 2,KCl 或 NaCl) ,阳离子选择性,低盐,阴离子选择性和另一个高盐液滴。使用电子显微注射器(方法)将它们沉积在含脂油中。液滴最初被单层脂质包围,在彼此接触后数秒内形成液滴界面双层(DIB) ,从而产生稳定的无支持结构(图1b)。为了激活电源,将组装好的液滴移入无脂油中去除油脂并拆卸 DIB。然后将液滴在4 °C 下凝胶以形成连续的水凝胶结构(图1c,补充图1和扩展数据图2)。

  我们的策略的一个主要优点是,在转移到无脂油和凝胶之前,每个液滴通过脂质双层与其邻居分离,这阻止了液滴之间的离子流动,同时机械地稳定了结构。在破坏绝缘脂质双层后,离子通过导电水凝胶从高盐到低盐液滴,通过选择性渗透隔室(补充注释1)。通过使用化学活性 Ag/AgCl 电极,从盐梯度释放的能量转化为电,并且水凝胶结构可以作为能源和动力外部组分(图1d)。脂质起着至关重要的作用,使得能够形成稳定的液滴网络,而不需要能量消耗和动力活性的按需激活; 我们的方法提供了一种在微观尺度上建立软离子动力源的方法,据我们所知,这在以前还没有实现(补充注释2)。

  除了液态油,我们还使用了一个热可逆的有机凝胶来拆卸 DIB,从而创建一个独立的,便携式液滴电源。将有机凝胶前体聚(苯乙烯 -b-乙烯-共丁烯 -b-苯乙烯)三嵌段共聚物(SEBS)溶解在高熔点烷烃混合物中以产生低于37 °C 的凝胶-液体转变温度(补充图2)。熔融的有机凝胶(37-40 °C)作为无脂培养基替代 DIB 拆卸过程中使用的无脂油。在4 °C 的凝胶过程中,有机凝胶随着液滴动力源一起凝固。凝胶化后,将有机凝胶-液滴复合物轻轻地从模具中分离出来,产生独立的、封装的液滴电源。有机凝胶封装可以支持压缩和扭曲(图1d) ,并防止生理环境中的离子泄漏(扩展数据图3) ,这大大扩展了液滴电源的可移植性和可穿戴应用。

  测量了单个功率单元在激活前后的电输出(图1e)。组装后,含脂油中的液滴(每个50nl,盐浓度梯度为200倍)通过 DIB 彼此粘附。我们离开结构在环境温度(25 °C)5分钟,让液滴部分凝胶和达到他们的平衡接触角。当我们将电极插入两个高盐度的端点液滴时,没有记录到电流,这表明 DIB 的绝缘阻止了能量消耗。然后,我们用无脂油去除脂质,在4 °C 触发完全凝胶化1分钟,从而建立离子传导途径。活化液滴电源在开路(VOC)时产生127mV,这个值与单个电细胞产生的电位(100-150mV)相当。短路电流(ISC)在几秒钟内达到2.2 μA 的峰值,然后由于所含盐的量有限(两个高盐液滴中的每个100nmol)而降低到较低的值,与模拟一致(补充图3)。输出电流在30分钟后保持,值约为30nA。此外,液滴电源可以根据需要储存和使用,由强大的水凝胶组合物(补充图4)和绝缘 DIB 确保。我们将液滴电源储存在含油脂的油中,以测试随着时间的推移能量的保存情况(图1f)。活化后的液滴电源在贮存36小时后,挥发性有机化合物的变化小于10% 。在同一时期内,由于失水,水滴的体积略有减少。

  为了提高液滴电源的输出性能,我们根据反向电渗析原理分析了几个影响发电行为的关键参数17,22: 选择性渗透膜上的离子梯度引起膜上的电压。首先,对盐的种类、浓度梯度和外阻进行了优化。在相同的盐浓度下,氯化钙比氯化钠和氯化钾产生的输出电压最高(补充图5a)。带电的有机化合物在某些条件下也可以产生浓度梯度,并用于建立电源(补充图5b)。增加高盐和低盐液滴之间的浓度比(梯度)增加了输出电压(扩展数据图4) ,但是降低低盐浓度以产生更大的比例导致由于液滴电源内阻增加而导致输出电流减少(补充注释3)。然后,使用最佳的200倍 CaCl2梯度,测量了输出电压、电流和功率对外部电阻的依赖关系,结果表明,由50nl 液滴组成的功率单元的电阻约为78kΩ,最大输出功率约为75nW。

  利用脂质支撑的水凝胶液滴构建软电源的优点之一是易于小型化。将液滴的体积从1000减少99.8% 至1.84 nl 导致输出电压(36% ,从136到87 mV)和电流(70% ,从2.7到0.83 μA; 图2a)。这些下降可能是由于液滴的内阻增加(补充说明3)和选择性液滴的浓度极化增加23。然而,与体积的减少相比,降低的幅度很小; 事实上,对于1.84 nl 的液滴,匹配电阻的平均能量密度大大增加了约100倍,达到约1300 W m-3,比之前的鳗鱼启发的设计增加了约680倍7,比随后的纸凝胶设计增加了约5倍8(图2b 和扩展数据表1)。尽管小型电源的总释放电荷较低(图2b 和补充图6) ,但我们可以串联和/或并联多个功率单元以增加输出电压和/或电流。VOC 随串联单元数量的增加而增加; ISC 和总释放电荷随串联单元数量的增加而增加(图2c)。

  对于大尺度的液滴网络,在不增加液滴厚度的情况下,增加不同功能液滴层之间的接触面积是非常重要的。这是因为液滴的内阻与接触面积呈负相关,与厚度呈正相关(补充说明3)。因此,保持较低的内阻ーー小尺寸ーー同时增加串联或并联单元的数量,分别增加输出电压或电流。为了扩大小液滴的组装以用于更大规模的应用,我们采用了模板方法,将多个液滴沉积到三维印刷的树脂模具中以产生预先设计的模式的动力单元(图3a,b)。从纳米尺度到微米尺度,模板辅助球形单元的自组装已被广泛用于制造图案化结构; 单元之间的吸引力和模板内的约束是自组装的两个必要条件。在我们的方法中,基于脂质的 DIB 的形成提供了液滴之间的吸引力(弹簧常数约为4mNm-1,拉伸强度约为25Pa),而模具的边界限制了它们的分离。

  我们制作了内径为600μm 的圆柱形模具,大约是4-nl 液滴直径的三倍。在每个模具中,我们沉积了7个液滴(4nl) ,它们在几秒钟内自发组装成一个六边形的“花状”图案(图3c,d 和方法)。接下来,我们在一个更深的圆柱形模具中堆积了五个自组装的液滴六边形,其内容相当于一个动力单元的五个液滴,从而在三维空间中形成了一个更大的动力源网络(图3e)。一个更大的20个六边形网络(28个单位,140个液滴)不到10分钟就建成了(图3e)。施工过程的自动化可以通过三维液滴打印机来实现,可以生产由数千个电源单元组成的液滴网络。

  为了证明多液滴组件的产量增加,我们在螺旋模具中串联组装了20个五液滴单元(图3f)。高盐液滴首先沉积,阳离子选择性液滴其次沉积,低盐液滴第三沉积,阴离子选择性液滴最后沉积(图3g)。模板在沉积过程中限制了液滴,DIB使液滴在链中紧密相连。在用无脂质油洗涤后保持该结构。螺旋电源可以点亮发光二极管,这需要大约2的外加电势 V(图3h)。输出功率足以用于其他应用,例如为电容器充电和为脉冲发生器供电(补充图7)。值得注意的是,液滴电源可以通过施加反向电势(200 mV)到液滴网络29,30,在十次放电后恢复到原始ISC的60%以上(补充图8)。

  我们研究了液滴装置对神经元活动的影响。高盐和离子选择性液滴一起可以作为一个开放的液滴装置,可以通过它的末端连接到外部元件上(图4a)。当该开放装置连接到离子浓度较低的液滴上时,完成了允许离子电流(约2.6 μA)流过所连接的液滴的导电途径(图4b,c 和补充图9)。如果神经元被包埋在低盐液滴中,产生的细胞外离子电流将调节个体神经元活动[4,31] ,并反过来反映神经元网络活动[32]。为了验证这一点,我们使用微流控装置来产生由基质胶球(直径约570μm)和人类神经祖细胞组成的神经微组织。将神经微组织用含有神经元培养基的低盐琼脂糖水凝胶包被以形成含有神经元的液滴(图4a,红色液滴; 方法和补充图10)。然后将液滴装置连接到圆形容器中含有神经元的液滴上(补充图11)。在高盐液滴中加入0.5 M CaCl 2后,神经元在10分钟的附着后保持高活力,如用 PrestoBlue 进行细胞活力测定,用钙黄绿素 AM 和碘化丙啶进行活死染色,以及用神经元标记物 TUJ1和细胞凋亡标记物 caspase 3进行免疫荧光染色所证实的(扩展数据图5)。使用 Fluo-4 Direct 作为细胞内钙染料28,33通过共聚焦成像测量神经元活性,其对细胞外钙没有反应(方法,补充注释4和补充图12)。时间推移记录揭示了当液滴装置连接到含有神经元的液滴时神经元调节的时空过程(图4d)。

  通过在不同培养期(3,10和17天)和离体小鼠脑切片(补充图13)后将基于 Ca2 + 的离子电流应用于神经微组织来证明神经元活性的调节。液滴装置在高盐液滴中含有0.5 M 的氯化钙。与0.5 M CaCl2液滴直接接触不产生离子电流,在附着的10分钟内神经元内没有明显的细胞内钙波动(扩展数据图6)。相比之下,当由液滴装置产生的离子电流从左向右流经1号液滴的神经网络时,观察到较强的荧光。此外,强化的荧光沿着第3天的神经微组织从左向右定向传播以形成波状荧光模式,表明第3天的神经微组织被离子电流局部调节(补充视频1)。为了进一步验证调节是由离子电流而不是通过改变特定离子(例如 Ca2 + 和 Cl -)的细胞外浓度来诱导的,我们使用 Ag/AgCl 电极将电输入应用于包埋在无 Ca2 + 液滴中的神经微组织(扩展数据图6)。由于 Ag/AgCl 电极的氧化还原化学作用,电输入可以诱导离子电流,而不会引起离子浓度的显著变化,例如 Cl- 梯度。我们观察到类似的细胞内 Ca2 + 波产生的神经元网络应用输入电流强度相当于我们的液滴装置(补充说明5)。此外,我们在用我们的液滴装置调制期间将膜电位敏感染料 FluVolt 应用于神经微组织,并观察到神经元膜电位的去极化(方法和扩展数据图7)。

  相比之下,在使用第17天神经微组织的实验中,在与液滴装置连接的15秒内同时调节液滴1中的神经元,而不显示先前用第3天神经微组织观察到的波状荧光模式(图4d 和补充视频2)。我们计算了每个网络的荧光中心(加权平均距离) ,以量化由荧光强度指示的离子电流调制的位移(图4e 和方法)。第17天的神经微组织显示与离体小鼠脑组织相似的荧光位移,其显着低于第3天和第10天的神经微组织中的位移(图4f 和扩展数据图8和9)。第17天的神经微组织也显示与第3天的对应物相比,诱导的 Ca2 + 波的传播速度更快,与之前的研究一致(补充图14)。这些结果表明,神经元在长时间培养过程中形成连接的神经元网络,因此在装置附着后显示出同步反应[37,38]。来自液滴装置的离子电流大概诱导了兴奋性信使的释放,这导致了整个相互关联的神经元网络的同时调节(补充注释5)。为了检验我们假定的网络活性与突触活性有关的假设,我们用30μMγ-氨基丁酸(GABA)处理第17天的神经微组织,GABA 是一种抑制性神经递质,降低细胞内电位,并相应地降低兴奋性输入的有效性40。死点